Предсказываемое и экспериментальное поведение гиалуроновой кислоты в растворе и в твёрдом виде.

Эта работа касается молекулярной характеристики полимерной цепи гиалуроновой кислоты. Главным объектом обсуждения является определение внутренней устойчивости длины ДП различными экспериментальными методами; ДП эквивалентна значению приблизительно 70 ?, что хорошо согласуется с данными, полученными молекулярным моделированием.

Исходя из этих значений, внутренняя вязкость и вязкости водных растворов как функции концентрации полимера и молярной массы в избытке соли, может быть предсказаны в оценке их отклонения от нуля согласно обычно принимаемому главному положению.

Обсуждается влияние температуры на подвижность цепи, как проверено ЯМР, молекулярным моделированием и экспериментами по измерению вязкости. Угловатость уменьшается прогрессивно с увеличением температуры в отношении с дестабилизацией сети водородных связей.

Структуры, полученные в твердом состоянии, хорошо согласуются с соответствующими низкоэнергетическими структурами, полученными методами молекулярного моделирования.

Гиалуроновая кислота, жесткость, структура, молекулярное моделирование, свойства растворов.

Гиалуроновая кислота (ГК) - естественный полисахарид, первоначально извлекаемый из различных источников и теперь чаще всего производимый путём бактериальной ферментации. В течение долгого времени наша экспериментальная работа выполнялась на бактериальных образцах, свободных от белков. Были разработаны различные эксперименты, чтобы охарактеризовать этот полимер и быть в состоянии интерпретировать его поведение в водных растворах. В первую очередь мы опишем поведение полимера в растворах. Потом будут выставлены некоторые результаты, полученные в твердом состоянии. Эти особенности будет обсуждаться, а также сравниваться с данными, полученными из молекулярного моделирования.

Бактериальная ГК произведена Soliance (Pomade, France) и тщательно очищена в форме натриевой соли в нашей лаборатории как описано выше. Различные молярные массы были получены обработкой ультразвуком (вниз к 300 000 г/моль) или кислым гидролизом (вниз к 85 000 г/моль) как обычно.

Образцы были охарактеризованы при помощи протонного ЯМР в D₂O, используя Bruker AC300 при различных температурах. Принятая концентрация составляла 5 мг/мл, но она может быть изменена в случае необходимости.

Распределение молекулярных масс определено методом исключения согласно хроматографии, использующей мультиугловой лазер с рассеивающим датчиком Wyatt DSP-F, связанный с дифференциальным рефрактометром. В качестве растворителя использовался 0.1 М NaNO₃; колонка – Shodex ОН 805 и 806. В растворителе использовалось соотношение dn/dc=0.142 мл/г при 30°С.

Вязкость разбавленных растворов как функция оценки сдвига определена путем использования Low Shear 40 от Contraves в диапазоне 10^-4 - 128 s^’в различных растворителях. Для более высокой вязкости используется оборудование с контролируемым напряжением; это - AR 1000 от TA Instruments. Температурный контроль позволяет работать в диапазоне 25°C < T < 80°C. Это оборудование также позволяет проводить динамические эксперименты в диапазоне от 10^-3 до 100 Гц.

Для молекулярного моделирования использовались стандартные протоколы, разработанные для моделирования полисахаридов. Главные результаты были освещены недавно. Эксперименты для малых углов нейтронного рассеивания (МУНР), были сделаны на спектрометре PACE (реактор Orphee, LLB Saclay, France), используя три установки. В первом случае мы анализировали q-диапазон 3.10^-3 – 3.3.10^-2 ?^-1 (? расстояние до датчика D=4.65 м, длина волны ?=13.14 ±1.00 ?); во втором q-диапазон 5.10^-3 – 5.33.10^-2 ?^-1 (? расстояние до датчика D=4.65 м, длина волны ?=8.09 ±0.50 ?) и в третьем q-диапазоне 1.37.10^-2 – 1.45.10^-1 ?^-1 (? расстояние до датчика D=2.264 м, длина волны ?=6.06 ±0.50 ?). q – рассеивающий волновой вектор, который эквивалентен:

Эксперименты по динамическому светорассеиванию (ДСР) были выполнены на спектрометре, оборудованном лазером с ионами аргона (Spectra Physics, модель 2020), действующем при A=488 нм, а также коррелятором ALV-5000 от ALV, Langen-FRG Instruments, компьютерно-контролируемом и осуществляющим пошаговое управление установкой при переменно-угловом определении системы и ячейкой для образцов с контролем температуры. Температура в экспериментах была (25 ±0.1°C) за исключением специально оговоренных случаев. Спектр рассеивания был измерен через полосовой фильтр (488 нм) и микроотверстие (50 урн) с трубкой фотоумножителя (ALV).

ГК была предметом множества исследований в нашей лаборатории, использовались бактериальные образцы с различным молекулярным весом. Этот растворимый в воде полисахарид рассматривается как типичный образец червеобразных цепей полимеров характеризующихся постоянной длиной развитой как следствие. Его гидрофильный характер так же, как и его относительная угловатость позволяют интерпретировать его поведение в растворе.

Ранее была описана модель, в которой цепи характеризовались внутренней постоянной длиной ДП (Lp), характеризующей локальную угловатость полимера. Если ДП определяется для нейтрального эквивалента цепи (экранирование электростатического отталкивания соляным дополнением) в водном растворе для заряженной молекулы, такой как ГК, то эффективная постоянная длина увеличивается за счёт электростатической постоянной длины (Le) из-за таких эффектов, как электростатическое отталкивание между соседними ионными участками. Тогда, длина постоянства в наших условиях:

Lt = Lp + Le

причём Le зависит от внешней концентрации соли. Известно, что есть отношение, выведенное Бенуа-Доте для червеобразных цепей в ?-условиях между радиусом циркуляции Rg, длиной контура L и ДП (Lp):

Rg² = L*Lp/3 - Lp² + 2 Lp³/L - 2 (Lp⁴/L²) [l-exp (-L/Lp)]

Тогда, в модели для данных термодинамических условий существует два электростатических вклада, которые добавлены следуя трактовке Оджика:

1) исключенный электростатический коэффициент объема, который может быть вычислен для каждого параметра заряда полиэлектролита, каждого М и каждой концентрации соли;

2) электростатическое постоянство - вклад длины цепи, упомянутый ранее.

Для температуры 25°C, внутренняя длина постоянства была вычислена и найдена равной 75 ?, что очень хорошо согласуется с экспериментальными данными. Та же самая обработка позволяет вычислить зависимость Lp(T) как показано в иллюстрации 1.

Иллюстрация 1. Изменение внутренней длины постоянства Lp в зависимости от температуры, полученное методом молекулярного моделирования.

Недавний анализ трех линий, полученных для SEC анализа, используя дифференциальный рефрактометр и мультиугловой лазер легкого рассеивания, датчик отражал распределение молекулярной массы различных образцов и молекулярного среднего веса без всякой калибровки. В особенности была проанализирована кривая, дающая радиус циркуляции как функцию молекулярной массы, используя модель червеобразной цепи, включая электростатический вклад.

Следуя этой процедуре, используя сделанное в домашних условиях программное обеспечение, мы в состоянии определить для каждой экспериментальной Rg (M) кривой, полученной из мультидатчика анализа SEC характерную внутреннюю длину постоянства Lp. Этот подход был недавно применен, и мы определили Lp=70 ?. Этот параметр также контролирует вязкость раствора, как будет обсуждаться позже.

Используя нейтронное рассеивание, определяется непосредственно длина постоянства. Фактически, можно сказать так, если длина контура цепи полимера (L) намного больше, чем общая длина постоянства (L_T), то цепь ведет себя как гауссовская катушка, тогда как, если L меньше, чем L_T, цепь ведет себя как прут. Можно выразить радиус циркуляции такой цепи использованием следующих отношений:

Это переход в кривой интенсивности рассеивания. «I» - как функция рассеивания волнового вектора q в q-диапазоне, где происходит переход между асимптотическими режимами «прут» и «катушка». В первом случае интенсивность q^-2-зависима, тогда как когда мы смотрим на меньшие расстояния, чем L_T, то интенсивность q^-1-зависима. Можно использовать график Кратки, чтобы определять внутреннюю длину постоянства Lp для ГК в разбавленном состоянии при 25°C. Эксперименты SANS были выполнены в присутствии большого избытка внешней соли. В этом случае полная длина постоянства эквивалентна внутренней (Lp=L_T), а электростатическое отталкивание экранируется. В данном графике представлена I(q)q², как функция от q, согласно показанному на иллюстрации 2.

Иллюстрация 2. График Кратки, полученный из SANS эксперимента для разбавленного раствора ГК, M_w=85000, в присутствии 0.1 М NaCl при 25°C.

Переход между состояниями «прутом» и «катушкой» происходит при q*. Из этого значения q* мы можем посчитать внутреннюю длину постоянства Lp, используя следующее соотношение:

Lp = 1.91/q*

Наибольшее значение Lp=95 ? характерно для полутвердого состояния ГК. Это значение немного отличается от значения, определенного из моделирования SEC анализа. Непрямое определение из значений Rg, так же хорошо, как и прямое определение из SANS экспериментов, даёт значения Lp значительно выше, чем это было опубликовано первоначально Клиландом (45 ?) и чуть позже Норсью (Lp около 40 ?).

D. Влияние температуры на жесткость

Молекулярным моделированием было показано, что угловатость цепи, характеризующейся внутренней длиной постоянства, уменьшается с ростом температуры. Такие же данные были также показаны в ходе ЯМР экспериментов и измерения вязкости.

Химическая структура молекулы ГК (в СОО- форме) показана на рисунке 3, полимер обычно используется в форме соли натрия.

Иллюстрация 3. Химическая структура ГК с изображением водородных связей, существующих в безводной форме.

Один из лучших методов для характеристики химической структуры ГК – это ЯМР. Отношение интегралов для групп –СН₃ и Н-1 эквивалентно 3/2 теоретической структуры. Но если ввести стандарт для калибровки сигналов (например, ДМСО в строго контролируемом содержании), то можно заключить, что пропорция между интегралом –СН₃ группы и стандарта может быть обеспечена очевидной степенью ацетилирования. Фактически все сигналы полимера изменены из-за сокращенного режима релаксации всех групп атомов в прямой зависимости от температуры. Иллюстрация 4 показывает развитие очевидной степени ацетилирования ГК в зависимости от температуры; сигнал, соответствующий заместителю ацетила увеличивается с увеличением температуры из-за дестабилизации внутренних водородных связей вдоль цепи вкупе с увеличением эластичности цепи. Уменьшение угловатости также сопровождается уменьшением внутренней вязкости с ростом температуры (иллюстрация 5).

Иллюстрация 4. Влияние температуры на степень ацетилирования ГК, определено ¹Н ЯМР в D₂O (M_w=85000, 5 г/л, т.е. 1.25 мономоль/л). Калибровка ДМСО в той же самой концентрации.

Иллюстрация 5. Изменение внутренней вязкости в зависимости от температуры. Эксперимент при 0.1 М NaCl, M_w=1350000.

Теория червеобразных цепей для внутренней вязкости была разработана Ямакава и Фуджи; из этой модели в ?-условиях:

[?] = Ф(Lr, dr)(M/L*Lp)^-3/2M^1/2

Где Lr и dr – соответственно уменьшенная длина и уменьшенный диаметр цепи; Lr эквивалентно числу сегментов Куна.

Итак, если Lp известно, то внутреннюю вязкость можно посчитать для любых термодинамических условий согласно соотношению Оджика, а затем пересчитать вязкость при данной концентрации полимера в избытке соли в оценке сдвига нуля согласно соотношению:

На рисунке 6 специфическая зависимость изображена при условии, что k^’=0.42 (хороший растворитель), В=7.77*10^-3 и n=4.18, как показано в нашей предыдущей работе. Эти экспериментальные значения также недавно обсуждались Ковманом и остальными.

Эта зависимость интересна и тем, что показывает частичное совпадение параметров C[?], продиктованных вязкостью раствора независимо от молярной массы или концентрации полимера.

Иллюстрация 6.Log ?_sp в окрестности нуля как функция от logC[?], C[?] – перекрывающийся параметр. Эксперимент проводился для различных M_w, в присутствии 0.1 М NaCl при 25°C.

В экспериментах по динамическому светорассеиванию (ДСР) при нормализованном времени измеряется автокорреляционная функция q⁽²⁾(q, t) интенсивности рассеивания. Последняя может быть выражена в терминах функции автокорреляции рассеянного электрического поля q⁽¹⁾(q, t) (структурный динамический фактор) через:

q⁽²⁾(q, t) = (I*(q,0) I(q,t))/(I(q,0))² = A + ?| q⁽¹⁾(q, t) |²

Где А – базовая линия, а ? – фактор когерентности, который в наших экспериментах равен 0.7-0.9. Иллюстрация 7 показывает логарифмическую зависимость q⁽¹⁾(q, t) для полуразбавленного раствора ГК при концентрации полимера 4*10^-4г/см³, в растворе 0.1 М NaCl при 25°C. Угол рассеивания равен 90°. В этом состоянии автокорреляционная функция рассеивающего электрического поля может быть описана суммой релаксационных состояний, широко разделенных во времени:

q⁽¹⁾(q, t) = A_fast(q)*exp(-t/?_fast) + A_slow(q)*exp(-t/?_slow)

?_fastи?_slow – соответственно быстрое и медленное времена расслабления, A_fast и A_slow – соответствующие амплитуды. Чтобы определить ?_fastи?_slow мы использовали метод Contin, основанный на обратных преобразованиях Лапласа для q⁽¹⁾(q, t). Иллюстрация 7 также показывает типичный пример результатов, полученных нами, применяя метод Contin к нашим данным для полуразведенного раствора ГК. Быстрые и медленные моды являются распространяющимися характерными временами ?_fastи?_slow обратно пропорциональными к q². Таким образом, возможно, вычислить для каждой концентрации полимера быстрый и медленный коэффициенты диффузии:

Быстрая мода сопровождается расслаблением колебаний концентрации полимера, характеризуется совместным механизмом распространения петель сети полимера, то есть, корреляцией петель сети полуразведенного раствора полимера. Медленная мода сопровождается формированием физических ассоциаций полимеров в полуразведенном режиме. Появление ассоциатов обычно не наблюдается у растворов с хорошим растворителем (второй вириальный коэффициент А₂> 0), а скорее требует растворов с ?-условиями или растворов в условиях низкой ионной силы. Мы думаем, что высокая жесткость ГК могла быть связана, в некотором роде, с происхождением этих ассоциатов.

Это должно быть важным - развить этот аспект структуры полуразведенных растворов и отношения с реологией.

Иллюстрация 7. Логарифмическая зависимость q⁽¹⁾(q, t) для полуразбавленного раствора ГК при концентрации полимера 4*10^-4г/см³, в растворе 0.1 М NaCl при 25°C. Угол рассеивания равен 90°. Также представлена нормализованная функция распределения времен распада, полученных методом Contin.

Эта техника использовалась, чтобы построить различные хелатные структуры, предсказанные для ГК; эти структуры были описаны выше. Целью было описать упорядоченное состояние твердого тела и сравнить эти данные с данными кристаллической структуры, описанными в литературе.

Плёнки с ГК в строго контролируемой ионной форме были расширены при контролируемом уровне относительной влажности, чтобы определить экспериментально их структуру и сравнить с данными, представленными в литературе так же, как и с данными, предсказанными молекулярным моделированием. Из предыдущего опыта исследования дифракционным рентгеноструктурным анализом волокон и сопутствующих структур идентифицировали несколько алломорфных структур, которые левозакручены 3- и 4-кратны свернуты, и 2-кратные хелатные комплексы с осевыми повышениями на дисахарид, что соответствует самой низкой энергии состояния посчитанной в нашем эксперименте.

Этот полимер используется в косметике благодаря своим хорошим гидратационным свойствам; его взаимодействие с водой было исследовано, используя DSC, чтобы отделить молекулы воды, которые находятся в очень сильном взаимодействии с определенными группами атомов ГК (первый слой) и затем более слабо взаимодействующие молекулы воды. В результате эксперимента пришли к заключению, что 17 молекул воды на дисахарид имеют очень сильное взаимодействие с ГК при RH на 100%. В данный момент проводятся дополнительные эксперименты с использованием ИК-спектроскопии.

ГК – интересный водорастворимый полимер; главным образом характеризуется высокой эластичностью полуразбавленных растворов в присутствии внешней соли. Реологические свойства этих растворов были описаны ранее. В этой статье были описаны последние новые данные относительно особенностей полимерных цепей ГК. ГК ведет себя как полутвёрдый полиэлектролит, характеризующийся внутренней длиной постоянства около 70 ?, которая прямым образом определяет общие свойства цепи так же, как и физических свойств таких, как вязкость. Эта статья демонстрирует, что молекулярное моделирование в состоянии предсказать эти особенности.