Противораковая деятельность гиалуронана.

Абстракт

Хотя гиалуронан (ГК), как было показано, модулировал клеточную пролиферацию в многочисленных типах клеток, немного известно о его эффекте на раковые клетки. Мы оценили антипролиферативную деятельность ГК с молекулярной массой 5.0-7.5 * 10⁵ Да на широком диапазоне типов раковых клеток. Мы выяснили, что ГК при низких концентрациях (<80 мкг/мл) ингибирует, в зависимости от добавленной дозы, пролиферацию раковых клеток простаты (LNCaP, PC 3, DU-145), раковых клеток мочевого пузыря (HT-1376, RT-4, T24 и UMUC-3), клеток рака молочной железы (МКФ 7), клеток меланомы (B16-F1) и клеток фибросаркомы (HT-1080). Присутствие многих механизмов спасения, связанных с прогрессией раковых заболеваний, таких как мутации p53/p21, Rb-мутации, удаление p16, Фас-устойчивость, отсутствие каспазы-3 и сверхэкспрессия P-гликопротеина, не затрагивало способность ГК ингибировать рост раковой клетки. Ингибирование пролиферации раковых клеток, казалось, было независимо от уровня экспрессии рецептора ГК CD44. Кроме того, мы выяснили, что ГК усиливает антипролиферативную активность антираковых агентов, основанных на нуклеиновых кислотах (микобактериальный стенной комплекс клетки и ДНК Mycobacterium phlei) и химиотерапевтических лекарственных средств (5-флуороурацил, цисплатин и тамоксифен). Наши данные указывают, что ГК, имея молекулярную массу 5.0-7.5 * 10⁵ Да, обладает значительным потенциалом для развития или как химиотерапевтический агент, или как дополнение к антираковым агентам.

Ключевые слова

Рак, пролиферация клеток, CD44

Введение

Гиалуронан (ГК) - главный неструктурный компонент соединительной ткани, важной для того, чтобы поддерживать внеклеточную матриксную структуру и обеспечивать клеточную подвижность, прилипание и пролиферацию. Низкая и высокая молекулярная масса ГК, как сообщали, обе модулировали пролиферацию некоторых нормальных (доброкачественных) типов клеток. ГК низкой молекулярная масса приблизительно от 1.3 до 4.5 * 10³ Да (3-10 дисахаридных единиц), но не ГК высокой молекулярной массы, как было показано, вызывала пролиферацию аортальных эндотелиальных клеток, эффект, который был коррелирован с увеличениями уровня белка киназы. Напротив, ГК приблизительно от 1.3 до 7.2 * 10³ Да (3-16 дисахаридных единиц) определенно ингибировал in vitro пролиферацию нормальных клеток эндотелия, но не нормальных фибробластов или нормальных гладкомышечных клеток. Для ГК высокой молекулярной массы, также было выяснено, чтобы она может и вызвать, и ингибировать пролиферацию некоторых типов нормальных клеток. ГК с молекулярной массой 1.1 * 10⁶ Да, казалось, стимулировал пролиферацию человеческих фибробластов, которые задерживались в матрице коллагена через расширенный синтез тубулина, а ГК 8.6 * 105 Да стимулировала быстрое увеличение роговичных эпителиальных клеток. Напротив, ГК от 4.0 * 10⁵ до > 1.0 * 10⁶ Да ингибировали пролиферацию нормальной эндотелиальной клетки и ГК > 1.0 * 10⁶ Да, как было показано, ингибировала пролиферацию синовиальных клеток нормального кролика и крысиных фибробластов клеточной линии 3T3. Кроме того, в концентрации менее, чем 1.0 мг/мл, ГК с молекулярной массой менее 1.0 x 10⁶ Да стимулировала пролиферацию синовиальных клеток нормального кролика и крысиных фибробластов клеточной линии 3T3. Несоизмеримые результаты, часто наблюдаемые с похожими формами препаратов ГК, могут быть связаны с различиями в экспрессии ГК рецептора, с концентрацией ГК или с присутствием простимулирующих примесей в препаратах ГК.

Хотя эффекты ГК и низкой, и высокой молекулярной массы на пролиферацию нормальных клеток были широко исследованы, об эффекте ГК на раковых клетках известно немного. In vitro, при концентрации более, чем 0.32 мг/мл, ГК от 1.3 до 5.6 * 10³ Да (3-12 дисахаридныхe единиц) и больше, чем 1.2 * 10⁶ Да ингибировали пролиферацию высоко опухолеобразующих, экспрессирующих рецептор CD44H, B16-F10 крысиных клеток меланомы от 50 до 90%. В концентрации менее 0.16 мг/мл, ГК немного стимулировал их пролиферацию. In vivo, при концентрации 1 мг/мл, ГК от 1.3 до 5.6 * 10³ Da подкожно управляли более чем 7 дней осмотическим насосом Алзета в промежуточной близости крысиной опухоли меланомы B16-F10, уменьшали объем опухоли на 85%. Эффект более высоких концентраций ГК, до 100 мг/мл, не имел значительно большей ингибиторной активности. К эффектам этого ГК на клетках опухоли было приписано разрушение комплексов ГК-CD44. Эффект ГК высокой молекулярной массы на рост опухоли B16F10 in vivo не был проверен. В этой статье мы оценили возможности фармацевтических препаратов ГК с молекулярной массой 5.0-7.5 * 10⁵ ДА, чтобы непосредственно ингибировать пролиферацию многих раковых клеток или усилить активность антираковых лекарственных препаратов, основанных на ДНК и хемотерапевтических средствах.

Материалы & методы

Клетки

Все линии клеток были получены из американской коллекции клеточных культур (ATCC, Роквилл, Мэриленд, США) и были выращены в среде, рекомендуемой ATCC. Таблица 1 показывает линии клеток, их происхождение и их свойства.

Реактивы

ГК 5.0-7.5 * 10⁵ Да были очищены из Streptococci sp. и растворены в стерильном солевом растворе в концентрации 0.8 мг/мл (Cystistat®, Bioniche Life Sciences Inc, Белвилл, Онтарио, Канада). МСС, микобактериальный стенной состав клетки, изолированный от Mycobacterium phlei (М. Phlei), где микобактериальная ДНК сохранена и связана в комплекс непосредственно с клеточной стенкой, был подготовлен Bioniche Life Sciences Inc. М. phlei ДНК была очищена, как ранее описано. Цисплатин, 5-флуороурацил и тамоксифен были получены из Sigma-Aldrich, Канада (Оквилл, Онтарио, Канада). Димемилтиазолдифенилтетразолиум бромид (MTT) от Ameresco (Солон, Огайо, США) и FITC-маркированные антитела к CD44 от BD Pharmingen (Mississauga, Онтарио, Канада).

Путь клеточной пролиферации

Раковые клетки были инкубированы в 6 отдельных отсеках пластины с культурой ткани в содержании 1.0 * 10⁵ клеток/мл в течение 48 часов с различными концентрациями ГК, МСС, M. phlei ДНК, цисплатином, 5-флуороурацилом и тамоксифеном. Пролиферация клеток была измерена, используя метод восстановления MTT. Кратко, 100 мкл 5 мг/мл MTT, растворенного в ПБС, были добавлены к каждому отсеку. После 4 часов инкубации было добавлено по 1.0 мл кислотного изопропилового спирта (0.04 N HCl в изопропиловом спирте) и ставший растворимым MTT был измерен при 570 нм, используя мультипластинный сканер.

Анализ экспрессии CD44

Экспрессия рецептора CD44 на поверхности клетки была измерена методом проточной цитометрии (FACScan, Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США), используя 1 x 10⁵ клеток с FITC-маркированным антителом к CD44 (клон G44-26), в условиях, описанных изготовителем.

Таблица 1. Раковые клетки, использующиеся в этом исследовании

Результаты & обсуждение

Ингибирование пролиферации раковой клетки

Способность ГК с молекулярной массой 5.0-7.5 * 10⁵ Да, чтобы ингибировать пролиферацию раковых клеток была оценена, используя различные крысиные и человеческие линии раковых клеток (Таблица 1). Как показано на рисунке 1, ГК располагается на шкале концентрации от 0.08 до 80 мкг/мл, ингибируя в зависимости от дозы пролиферацию раковых клеток простаты (PC 3, LNCaP, DU-145), клеток рака молочной железы (МКФ 7), клеток меланомы (B16-F1) и клеток фибросаркомы (HT-1080). Раковые клетки пузыря (UMUC-3, RT-4, HT-1376, T24) были менее чувствительными к ГК, чем другие проверенные линии клеток и степень ингибирования их пролиферации не увеличивалась с увеличивающимися концентрациями ГК (рисунок 1). Раковые клетки гематопоэтического происхождения, лейкемии и лимфомы (Jurkat T, THP-1, K562 EL-4), не отвечали на ГК обработку при используемых концентрациях (рисунок 1). Не было замечено, что ингибирование пролиферации раковых клеток ГК имело место быть коррелированным с присутствием любых специфических механизмов спасения (таблица 1).

Иллюстрация 1. Раковые клетки были инкубированы в 1 * 10⁵ клеток/мл с различными концентрациями ГК на 48 часов при 37°C, 5%-ый CO₂. Клеточная пролиферация была определена сокращением MTT, как описано в Материалах & Методах. Показанные результаты являются усредненными из трех независимых экспериментов. С.О. составляли меньше чем 10 % и не были показаны.

Уровень экспрессии CD44

Мы определили, наблюдалась ли корреляция между антипролиферативной активностью ГК и уровнем экспрессии CD44. Гликопротеин CD44 - главный внеклеточный рецептор для ГК. Рецептор CD44 связан со злокачественными процессами в нескольких типах рака и, как было показано, способствует выживанию раковых клеток. Разрушение функции CD44 в крысиной грудной карциноме, как сообщали, вызвало апоптоз. Экспрессия CD44 раковыми клетками была оценена, используя антитело (клон G44-26), которое узнает домен, общий у всех изоформ CD44. Как показано в таблице 2, мы выяснили, что раковые клетки, используемые в этом исследовании, экспрессировали переменные уровни CD44 на поверхности клетки.

Таблица 2. Экспрессия CD44 на поверхности клеток

* значимая единица флуоресценции Мы не обнаружили корреляции между уровнем экспрессии CD44 и способностью ГК ингибировать пролиферацию при любой концентрации (p>0.4). Например, раковые клетки простаты LNCaP отвечают на ГК при отсутствии обнаружимого количества CD44 на поверхности клетки, в то время как T-24 и UMUC-3, которые показывают высокие уровни экспрессии CD44 на поверхности клетки, незначительно отвечают на воздействие ГК. Однако, с тех пор как было описано более десяти изоформ CD44, мы не можем исключить возможность, что отдельная изоформа CD44 может быть связана с антипролиферативной активностью, наблюдаемой с ГК. Эта антипролиферативная активность могла также быть связана с другим ГК рецептором. В частности RHAMM и его изоформы были вовлечены в регулирование развития клеточного цикла. Например, сверхэкспрессия RHAMM путём трансфекции в доброкачественные фибробласты, как показывали, преобразовало эти клетки в полностью метастатическую фибросаркому.

ГК усиливает активность антираковых агентов, основанных на ДНК

МСС, приготовление микобактериальной клеточной стенки, где микобактериальная ДНК сохранена и связана в комплекс с клеточной стенкой, и M. phlei ДНК, обладает антираковой активностью против различных типов рака. Более подробно, МСС, как было показано, непосредственно вызывал апоптоз в человеческих раковых клетках пузыря. M. phlei ДНК, связанная с МСС, ответственна за ее про-апоптотическую активность. МСС, кажется, добивается своей антираковой активности, модулируя экспрессию многих онкогенов, цикл клетки связывает белки и гены, регулирующие апоптоз. Мы проверили, может ли ГК усиливать активность МСС или M. phlei ДНК против раковых клеток простаты и пузыря. Мы выяснили, что ГК при различных концентрациях может действовать синергистически с МСС или M. phlei ДНК. Как отображено на иллюстрации 2, ГК в концентрации 0.8 мкг/мл усиливает активность МСС и M. phlei ДНК и для PC-3 раковых клеток простаты (рисунок 2a) и для RT-4 раковых клетки пузыря (рисунок 2b). Эксперименты находятся в стадии реализации, чтобы помочь понять, почему ГК действует синергистически с МСС и M. phlei ДНК. Одно возможное объяснение этой синергистической деятельности - защита ДНК от деградации в присутствии деоксирибонуклеаз в растворе (рукопись в стадии подготовки). Другая возможность – дифференциальная активность ДНК и ГК на развитие клеточного цикла. ГК, как показывали, присутствовал в ядре клеток, предполагая, что ГК может быть вовлечен в функцию ядрышек, хромосомную перестройку или другие события в пролиферации клеток.

ГК усиливает активность антираковых лекарств

Мы определили, может ли ГК также усиливать деятельность химиотерапевтических лекарственных препаратов. Эти исследования были выполнены при концентрации ГК, не имеющей ингибиторной активности. Как показано на иллюстрации 3, мы выяснили, что ГК в концентрации 0.008 мкг/мл может усиливать деятельность цисплатина, агента алкилирования, и 5-флуороурацила, антиметаболита ДНК/РНК, против RT-4 раковых клеток пузыря. Мы также проверили деятельность ГК в комбинации с тамоксифеном, препаратом антирака, используемым при лечении рака молочной железы. Тамоксифен, антагонист рецептора эстрогена, может также непосредственно вызывать апоптоз в раковых клетках молочной железы. Мы обнаружили, что ГК в концентрации 0.008 мкг/млl взаимодействует синергистически с тамоксифеном против MCF-7 раковых клеток (рисунок 3). Наши данные предполагают, что синергистическая активность, наблюдаемая у ГК при взаимодействии со многими антираковыми препаратами (МСС, M. phlei ДНК, цисплатин, 5- флуороурацил и тамоксифен), кажется, независима от их механизма действия. Кроме того, недавно было показано, что ковалентное связывание ГК с бутиратом натрия есть антиканцерогенная структура, которая улучшает антипролиферативную активность бутирата по отношению к клеткам MCF-7 рака молочной железы.

Заключение

Наши данные показывают, что ГК, очищенный из Streptococci sp. и имеющий молекулярную массу 5.0-7.5 * 10³ Да имеет прямую антипролиферативную активность на ряде раковых клеток при низких концентрациях (0.8-80 мкг/мл). Во многих проверенных линиях раковых клеток ингибирование пролиферации гиалуронаном было значительно меньше при его самой высокой используемой концентрации. Раковые клетки, происходящие из костного мозга, кажется, нечувствительны к ГК при проверенных концентрациях. Активность ГК, казалось, была независима от присутствия многих механизмов спасения, связанных с прогрессией рака, и присутствия CD44 на поверхности клетки. ГК также усиливает активность ряда антираковых лекарственных препаратов, имеющих различные механизмы действия. Наши данные указывают, что ГК, имея молекулярную массу 5.0-7.5 * 10⁵ Да имеет значительный потенциал для развития как химиотерапевтический агент или как дополнение к антираковым агентам.

Иллюстрация 2. РС-3 ячейки (a) или RT-4 клетки (b) были инкубированы в 1 * 10⁵ клеток/мл с 0.8 мкг/мл ГК одного или в комбинации с увеличивающимися концентрациями МСС или М. phlei ДНК в течение 48 часов при 37°C, 5%-ый CO₂. Клеточная пролиферация была определена восстановлением MTT, как описано в Материалах & Методах. Показанные результаты являются усредненными из трех независимых экспериментов. С.О. составляли меньше чем 10 % и не были показаны.

Иллюстрация 3. RT-4 клетки были инкубированы в 1 x 10⁵ клеток/мл с 0.008 мкг/мл ГК, 0.1 мкг/мл цисплатина или 1.0 нг/мл 5-флуороурацила (5-FU) одного или в комбинации в течение 48 часов при 37°C, 5%-ый CO₂. Клетки MCF-7 были инкубированы в 1 x 10⁵ клеток/мл с 0.008 мкг/мл ГК или 0.1 мкг/мл тамоксифена, одного или в комбинации в течение 48 часов при 37°C, 5%-ый CO₂. Клеточная пролиферация была определена восстановлением MTT, как описано в Материалах & Методах. Показанные результаты являются усредненными из трех независимых экспериментов. С.О. составляли меньше чем 10 % и не были показаны.