Все процедуры
Узнать цену
Задать вопрос
Личный кабинет

Экспрессия гиалуронан-синтазы в оболочке матки человека во время менструального цикла.

Абстракт

Человеческая оболочка матки подвергается обширной реконструкции во время менструального цикла в подготовке благоприятной окружающей среды для оплодотврения. Двухфазные колебания гиалуроновой кислоты (ГК) в циклической оболочке матки были продемонстрированы с пиками, происходящими во время ранней пролиферативной (дни 6-8) и середине секреторной (дни 19-23) стадии цикла. Вторые пики ГК в середине секреторной стадии достигают максимума, охватывает время внедрения эмбриона, что предполагает возможную роль ГК в этом процессе. Цель данной работы состояла в том, чтобы исследовать образцы экспрессии 3-х иззоформ гиалуронан-синтаз (ГКС): ГКС 1, ГКС 2 и ГКС 3.

Скрещивание in situ было выполнено на зафиксированной формалином эндометриальной ткани через цикл, чтобы определить, экспрессирубтся ли эти ферменты в человеческой оболочке матки и если так, их клеточный источник. Рибопробы были построены для каждого, ГКС: ГКС 1 (64bp), ГКС 2 (60bp) и ГКС 3 (550bp), и маркированы дигоксигенином (ДИГ). Белок ГКС был также локализован иммуногистохимически, используя многоклональные антитела против внеклеточного пептида ГКС. У всех трех форм ГКС в человеческой оболочке матки были экспрессированы мРНК. Экспрессия наблюдалась и в стромальных, и в железистых эпителиальных клетках с самой большой интенсивностью и значительных циклических изменениях в эпителиальных клетках. Во обоих случаях уровень экспрессии мРНК был низким во время менструации (дни 1-5). Уровни увеличивались повсюду во время пролиферативной стадии (дни 6-14) цикла, и для ГКС 2 и ГКС 3 оставались поднятыми до середины секреторного цикла (дни 19-23)/фаза внедрения. Экспрессия ГКС 1 временно уменьшена во время последней пролиферативной стадии (дни 12-14). Следующая затем экспрессия во время фазы внедрения для всех типов ГКС существенно уменьшена. Был продемонстрировано, что белок ГКС локализован на плазматической мембране и в железистых эпителиальных, и в стромальных клетках.

Частичная корреляция между ГК и ГКс поддерживает роль этих ферментов в эндометриальном регулировании ГК во время менструального цикла и также предполагает жесткий контроль уровня экспрессии фермента.

Ключевые слова

Оболочка матки, гиалуроновая кислота, гиалуронан-синтаза

Введение

Во время менструального цикла архитектура оболочки матки подвергается динамической реконструкции в подготовке благоприятной окружающей среды для внедрения бластоцисты. Яичниковые стероидные гормоны были приняты как основные дирижеры этого процесса, которые и ответственны за быстрое увеличение и дифференцирование эпителиальных и стромальных клеток в создании восприимчивой оболочки матки. Человеческая оболочка матки обычно - враждебное окружение для внедрения эмбриона, но в течение нескольких дней в каждом менструальном цикле, это достигает уникального состояния восприимчивости, тогда, если соответствующая реконструкция произошла, а эмбрион внедрился, то будет возникать беременность. В отсутствии внедрения регресс ткани происходит сопровождаемый потерей функционального слоя во время менструации (день 1-5) и регенерация отторгнутой ранее ткани. Базальный слой ответственен за регенерацию, которая максимальна до овуляции (день 14), во время пролиферативной стадии цикла (дни 6-14). Ре-эпителизация, замена кровеносных сосудов, многочисленные подразделения клеток и производство внеклеточных матричных компонентов характеризуют пролиферативную стадию. Во время следующей овуляции клетки дифференцируются, появляется увеличение степени гидратации ткани и увеличиваются уровень секреции желез в полость клетки. Эту последнюю часть цикла называют секреторной фазой (дни 15-28). Всюду по пути прохождения цикла оболочка матки преобразовывается от тонкой плотной ткани в толстую, очень водопроницаемую секреторную ткань.

Гиалуроновая кислота - главный компонент большинства внеклеточного матриксов, был идентифицирован в человеческой эндометриальной строме во время менструального цикла. Двухфазные колебания Гиалуроновой кислоты происходят всюду по пути цикла с пиками во время раннего пролиферативного периода и в середине секреторных фаз. Высокий уровень Гиалуроновой кислоты - общий компонент тканей с быстрым быстрым увеличением количества клеток, и это может объяснить поднятый уровень Гиалуроновой кислоты во время ранней пролиферативной стадии менструального цикла. Кроме того высокий уровень Гиалуроновой кислоты был положительно коррелирован с процессом митоза, запрещая дифференцирование клетки и, следовательно, создавая окружающую среду, способствующую быстрому увеличению числа клеток. Гидратированный матрикс также поощряет распространение факторов роста, таких, как TGF-? и обеспечивает защиту цитокина от протеолитических ферментов. Во-вторых, пик Гиалуроновой кислоты середины секреторного периода охватывает время внедрения. Было предположено, что богатый ГК матрикс мог облегчить вторжение в строму во время этого процесса. Эти данные поддерживают роль Гиалуроновой кислоты в подготовке оболочки матки для внедрения эмбриона, рещающего шага в установлении беременности. Однако, ничего не известно о том, как регулируются пики Гиалуроновой кислоты в оболочке матки. Цель данного исследования состояла в том, чтобы заняться исследованиями образцов экспрессии ГКС, ферменты, ответственных за Гиалуроновой кислоты синтез. ГКС - мультигенная семья с тремя известными участниками, ГКС 1,-2 и-3. Каждый ГКС имеет отдельные ферментативные свойства в терминах стабильности фермента, шкалы удлинения и длины цепей синтезируемых Гиалуроновой кислоты.

Материалы и методы

Коллекция тканей

Эндометриальная ткань была получена в кюретаже от 84 женщин (3 полных цикла) без очевидных эндокринологических проблем и с нормальной эндометриальной гистологией. В течение прошлых 12 месяцев ни одна из пациенток не получала обработки стероидами. Согласие на основе полной информации было получено от каждой пациентки, и одобрение было дано Человеческим Комитетом по Этике в Медицинском Центре Монаш, Мельбурн, Австралия. Эндометриальное датирование было подтверждено независимой гистологической экспертизой.

Исследования РНК и in situ гибридизация

ГКС 1 (64bp), ГКС 2 (60bp) и ГКС 3 (550bp) кДНК, были клонированы в экспрессионный вектор pGEM-T (Гэри Браунли, Университет Монаш, Австралия). Плазмиды с ГКС были обработаны рестриктазами Not I и Nco I, чтобы произвести чувствительные и нечувствительные образцы, которые были затем маркированы доксигенином (ДИГ), маркирующим РНК.

ГКС мРНК, была локализована в последовательных секциях (5 микронов), фиксированных формалином, покрытой парафином эндометриальной ткани in situ скрещиванием, как ранее описано. Чтобы добиться проницаемости ткани, секции были инкубированы в протеиназе К (12 мкг/мл) при 37°C в течение 30 минут, а после фиксированы 4%-ым параформальдегидом при 4°C в течение 10 мин. Секции были обработаны ацетилатом до предскрещивания. Гибридизация была проведена в течение примерно 16-ти часов при 42°C для ГКС 2,-3 и при 48°C для ГКС 1 с концентрациями исследования 20, 18, и 10 нг/мкл соответственно. Образцы были растворены в буфере для гибридизации, содержащем 10%-ый сульфат декстрана в дополнение ко всем компонентам раствора для предскрещивания. Секции подверглись длительному промыванию при температуре скрещивания и, чтобы уменьшать фон, были инкубированы с РНКазой (20 мкг/мл) при 37°C в течение 30 мин. Скольжения были заблокированы 10%-ой нормальной сывороткой овец, 10%-ой эмбриональной сывороткой теленка и 0.1 % тритоном X-100 в течение 30 мин. Секции были инкубированы с Анти-ДИГ-AP (1:750) в блокирующем растворе в 4°C на ночь. Азотноголубой тетразолиум/5-бромо-4-хлоро-3-индоифосфат был применен, и секции были инкубированы в темноте в течение 1-5 часов при комнатной температуре. ГКС мРНК был представлен смещением синего цвета в строну фиолетового. Секции не были противоокрашиваемыми.

Оценка in situ скрещивания

Чтобы определить эндометриальную активность для экспрессии ГКС мРНК, была оценена красящая интенсивность клеток. Два наблюдателя, использующие легкий микроскоп, градуировали относительную интенсивность осадителя. Относительная интенсивность была оценена полуколичественно в масштабе с 5 уровнями следующим образом: очень слабый, 1; слабый, 2; умеренный, 3; сильный, 4 и очень интенсивный, 5.

Иммуногистохимия

Иммунологическое обнаружение ГКС в эндометриальной ткани, был предсформирован, используя многоклональное человеческое антитело, перекрестно реагирующее с внешними пептидами, ГКС 1,-2 и 3 (Трейси Браун, Университет Монаш, Австралия). Гидратированные 5 мкм парафина секции были преобработаны трипсином на 0.2 %/ПБС в течение часа при 37°C. Белки были заблокированы с 10%-ым ФЦС/ПБС, следуя обнаружению ГКС с многоклональными антисыворотками (1:250) при 37°C в течение 1 часа. Эндогенная пероксидаза была устранена инкубацией в растворе 0.6 % пероксид водорода/метанол в течение 20 мин. Заключительная визуализация была выполнена с антивеществом IgG/ХРП (1:100) в течение 1 часа при 37°C, следуя реакции с ГКС локализацией белка, была определена дополнением колориметрического основания 3,3 '-диаменобензидин тетрагидрохлорид (ДАБ). Секции были противоокрашиваемыми с гематоксилином, обезвоженным и фиксированным.

Результаты и обсуждения

Чтобы идентифицировать какие изоформы экспрессируеются в человеческой оболочке матки и их участок, была проведена гибридизация in situ ГКС 1,-2 и-3 (Рис. 1). Секции, фиксированные формалином были исследованы с ДИГ-маркированными антисмысловыми РНК пробами для каждого ГКС, а кодирующие образцы были использованы как контроли для неспецифической гибридизации.

Гиалуроновая кислота

Иллюстрация 1. Клеточное местоположение ГКС мРНК в человеческой оболочке матки во время середины пролиферативной фазы (день 10) менструального цикла. ГКС 1,-2 и-3 мРНК (А, С и E соответственно) были обнаружены в оболочке матки методом in situ гибридизации и ограничены преобладающе в железистых эпителиальных клетках с менее интенсивным окрашиванием в окружающей строме. Последовательные секции контроля, инкубированные с ГКС 1,-2 и-3 кодирующими рибопробами (B, D и F соответственно) не показали определенного окрашивания (увеличение в 20 раз).

Все типы ГКС были экспрессированы в оболочке матки и стромальными, и железистыми эпителиальными клетками однако, больший уровень экспрессии был показан в железистом эпителии (Рис. 1). Данное местоположение эндометриальных ГК несколько удивительно, как преобладающе стромальное, и предполагает, что местом произведения ГК железистыми ГКС может быть поперечная базальная мембрана. Иммуногистохимия также проводилась на эндометриальных образцах, используя поликлональные антитела, поперечное реагирующие с ГКС 1,-2 и-3 и показала преобладающую локализацию ГКС в железистых эпителиальных клетках, таким образом, подтверждая на месте исследования локализации (данные, не представленные).

Экспрессия ГКС 1,-2 и-3 продемонстрировала значительные изменения всюду в пределах менструального цикла (Рис. 2). Уровень ГКС и в железистых эпителиальных, и в стромальных клетках был низок во время менструальной фазы (дни 1-5) цикла. В это время происходит расформирование ткани, и эндометриальный слой теряется. У ровень ГКС 1 увеличивается во время ранней пролиферативной стадии (день 6) вкупе с увеличением ГК, вероятно из-за обширного быстрого увеличения, требуемого восстановить функциональный эндометриальный слой. Во время середины пролиферативной стадии (дни 9-11) цикла экспрессия ГКС 1, остается поднятой, однако, уровень ГК уменьшается. Около 13 дня экспрессия ГКС 1 внезапно уменьшается. Ранняя секреторная фаза (дни 15-18) цикла отмечена увеличением транскрипции ГКС 1, случай, хорошо коррелирующий с наступающим достижением максимума ГК при внедрении. Существенное уменьшение уровня ГКС 1 наблюдается в день 19 и остается низким везде до окончания цикла. Это кажется соответствующими данными событиям, происходящим в оболочке матки на данном этапе. Если цикл неплодороден, происходит регресс оболочки матки, вероятно, из-за потери воды в ткани.

Экспрессии ГКС 2 и-3 во время менструального цикла, отличаются немного от того, что происходит с ГКС 1. Низкие уровни экспрессии очевидны во время менструаций (дни 1-5) и ранней пролиферативной фазы (дни 6-8). Экспрессия не увеличивается до наступления дня 9, несколько позже чем увеличение уровня экспрессии ГКС 1 в течение этого времени цикла. Экспрессия остается поднятой до дня 18 секреторной фазы (дни 15-28), после которого её уровень существенно уменьшаются.

Экспрессия ГКС частично коррелирована с ГК содержанием во время менструального цикла, как демонстрируется низкими ГКС/ГК уровнями во время менструаций и середины/конце секреторной фазы. Между менструацией и серединой секреторной фазы уровень экспрессии ГКС остается поднятым, в то время как уровни ГК показали два пика, отделенные между собой ГК-депрессией. Это предполагает, что эндометриальное содержание ГК исключительно не отрегулировано экспрессией ГКС, и подразумевает возможную роль деградативных гиалуронидаз.

Возможная причиня для поднятия уровня ГКС во время ГК-депрессии может быть связана с перестройкой сосудистой системы и ангиогенезом, происходящим в пределах оболочки матки. Было выяснено, что частичные продукты деградации ГК, между 4 и 25 дисахаридами по длине, вызывают ангиогенетический ответ. Кроме того, ангиогенез в оболочке матки достигает самого большого уровня во время середины последней пролиферативной фазы и во время ранней секреторной фазы, как определено уровнями сосудистого эндотелиального фактора роста, ангиогенетического маркера и его рецепторов киназы тирозина Flt-1 и KDR/Flk-1.

Заключение

Полученные результаты подтверждают роль всех трех ГКС изоформ в эндометриальном производстве ГК и вероятную роль ГКС в эндометриальном ГК-регулировании, хотя это, кажется, не единственный регулирующий механизм.

Гиалуроновая кислота

Иллюстрация 2. Экспрессия ГКС в человеческой оболочке матки во время менструального цикла, как определено in situ гибридизацией. Секции с каждого дня цикла (n=3) были исследованы с ГКС 1 (A), ГКС 2 (B) и ГКС 3 (C), ДИГ-маркированными рибопробами. Экспрессия была количественно определена визуально в обоих типах клеток: железистых эпителиальных и стромальных. Уровень ГК также показан, как определенный Саламонсен и др, чтобы помочь в определении корреляции между ГК и ГКС.

Уведомления

Авторы уведомляют о финансовой поддержке от Meditech Research Limited, Level 1, Sterling House, 8 Parlament Place, West Perth, 6005 Australia.