Что такое cross-linking (кросс-линкер)?

Использование гиалуроновой кислоты как основы для производства биоматериалов предоставляет много преимуществ. Помимо синтеза производных гиалуроновой кислоты, еще одним способом изменения физико-химических свойств гиалуроновой кислоты является формирование поперечных связей. В зависимости от молекулы, образующей поперечный мостик и условий реакции, может быть получен широкий спектр материалов гиалуроновой кислоты, начиная от пленок с относительно низким содержанием воды, до гидрогелей с высоким ее содержанием. Большинство методов получения гиалуроновой кислоты с поперечными связями относится к одной из двух схем: одностадийный процесс экспозиции гиалуроновой кислоты с веществом, образующим поперечные мостики (кросс-линкером), либо двухстадийный процесс, при котором вначале синтезируются высоко-реактивные производные гиалуроновой кислоты, а в последующей реакции происходит образование поперечных мостиков. Ниже перечислены основные методики введения перекрестных связей в гиалуроновой кислоте.

Почти 40 лет назад, Laurent с коллегами, используя диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, получил гидрогели гиалуроновой кислоты с поперечными сшивками из диэпоксидов. Другие исследователи расширили возможности диэпоксидной химии другими кросс-линкерами, включая диглицидиловый эфир этиленгликоля ( бифункциональный кросс-линкер ) и полиглицедиловый эфир полиглицерина ( трифункциональный кросс-линкер ). Примечательно, что детальное изучения химии этих реакций показало, что при низком pH диэпоксиды формируют эфирные связи между карбоксильными группами, в то время как при высоком pH, они формируют эфирные связи между гидроксильными группами. ( Рис. D ). Учитывая эти свойства, проводится двойное поперечное сшивание гиалуроновой кислоты с использованием диэпоксиоктана. Вначале гиалуроновая кислота реагирует с диэпоксиоктаном при низком рН, при этом формируются эфирные связи между карбоксильными группами ГК цепей. Вторая реакция с диэпоксиоктаном проводится при высоком pH, при этом формируются эфирные поперечные сшивки между гидроксильными группами гиалуроновой кислоты.

Карбодиимиды используются обычно для проведения реакций между карбоновыми кислотами и аминами. Данные реакции, однако, высокочувствительны к pH и при проведении реакций с гиалуроновой кислотой часто образуются нереакционноспособные функциональные группы ( уреиды ). Таким образом, области применения карбодиимидов в данном случае ограничены. К счастью, отдельным исследователям удалось подобрать специфические условия, при которых возможно проведение карбодиимидных реакций с формированием поперечных связей.

Наиболее простой из этих методов использует только карбодиимид для стимуляции образования меж- и внутримолекулярных поперечных связей на гиалуроновой кислоте. Другими словами, эти материалы могут быть синтезированы без использования экзогенных агентов образования поперечных связей. Для образования поперечных связей реакция с карбодиимидом проводится в виде пленок, содержащих не менее 70% гиалуроновой кислоты в растворах ацетона или водном растворе спирта. Аналогичные реакции в растворе гиалуроновой кислоты не приводят к образованию поперечных связей, вероятно, по причине образования неактивных ацил-уреатов. Борясь с этой тенденцией формирования неактивных ацил-уреатов при воздействии карбодиимидов на ГК, ученые, разработали технику образования поперечных связей в реакции с бис-карбодиимидами. ( Рис. E ). Были синтезированы и ковалентно присоединены к гиалуроновой кислоте несколько бис-карбодиимидов, по механизму, аналогичному образованию неактивных ацил-уреатов, образуя тем самым ароматические или алифатические связи между молекулами гиалуроновой кислоты.

Кроме того, были успешны попытки использования карбодиимидов для реакции между карбоксильными группами гиалуроновой кислоты и аминами бифункциональных кросс-линкеров. ( Рис. F ). Ученые Bullpitt и Aeschlimann использовали реакцию карбодиимида и 1-гидроксибензотриазол ( HOBt ) для образования связи между активированными аминами ( pKa<8.0; например, дигидразидом ) и карбоксильными группами гиалуроновой кислоты. Для образования связи между гиалуроновой кислотой и простыми первичными аминами ( pKa>9.0; например, 1,4-диаминобутан дигидрохлорид ) использовался карбодиимид и N-гидроксисульфосукцинимид. Подобным образом ученые Vercryusse и соавт. синтезировали множество поливалентных гидразидных агентов для поперечной сшивки ( 2-6 гидразидов на агент ) для использования в реакциях образования поперечной связи с использованием карбодиимидов.

Формальдегид и глютаральдегид долгое время применялись для образования поперечных связей у белков с целью консервации тканей. Формальдегид используется при синтезе некоторых препаратов. Это растворимый вариант гиалуроновой кислоты с поперечными мостиками, который в то же время более вязкий и эластичный, чем нативная гиалуронова кислота. Поперечное сшивание глютаральдегидом используется с целью получения материалов с высокой устойчивостью к расщеплению. Ученые Tomihata и Ikade провели реакцию с глютаральдегидом в подкисленном водном растворе ацетона для получения пленок гиалуроновой кислоты с поперечными сшивками и с малым содержанием воды. Потом сравнили реакции с глютаральдегидом и карбодиимидные реакции, и обнаружили, что при использовании глютаральдегида образуются продукты с большим количеством поперечных связей. Данные продукты подходят для использования в качестве объемных каркасов для тканей.

Нерастворимые гидрогели гиалуроновой кислоты могут быть получены при перекрестном сшивании гиалуроновой кислоты бутадиенсульфоном ( Рис. G ). При высоком pH бутадиенсульфон образует сульфонил-диэфирные сшивки между гидроксильными группами ГК. В зависимости от условий реакции, могут быть получены различные продукты, начиная от мягких гелей и заканчивая прочными пленками (например, таким способом можно получить мембраны и полые трубки). Такой препарат способен более длительное время оставаться в организме, чем нативная гиалуроновая кислота, особенно в тех местах, где на имплантат почти не действуют механические силы.

Методы, обсуждаемые выше, позволяют получить широкий спектр стабильных продуктов, однако большинство из них проводится при условиях, выходящих за физиологические пределы организма. Более того, во многих случаях поперечные сшивки начинают образовываться сразу же после контакта гиалуроновой кислоты и агента. И вследствие того, что гиалуроновая кислота образует растворы с высокой вязкостью, зачастую гомогенный продукт таким способом получить трудно. Фотополимеризация – реакция, которая происходит только при экспозиции светом нужной длины волны. Таким образом, реагенты могут быть полностью перемешаны до начала проведения реакции. Более того, реакции фотополимеризации можно проводить при физиологических условиях без неблагоприятных эффектов на участвующие в реакции биоактивные молекулы или инкапсулированные клетки. Для этих целей проведена фотополимеризация гиалуроновой кислоты с несколькими группами веществ, в том числе с циннамоилом, кумарином, тимином; метакриловым ангидридом; глицидилметакрилатом; и стиролом. ( См. рис. H, на котором схематично изображены метакрилатные производные гиалуроновой кислоты, полученные путем фотополимеризации ). Кроме того, возможна дальнейшая модификация сульфатированной ГК 4-азидоанилином. Данная модификация позволяет получить производное гиалуроновой кислоты, формируемое в объекты размером всего 100 мкм, что, в свою очередь, может использоваться для направления роста клеток или адгезии в новых биоматериалах.