Конструирование хрящевой ткани с использованием гидрогелей.

Следующий текст является коротким обзором недавних работ в области конструирования хрящевой ткани с использованием природных и синтетических гидрогелей. Обзор охватывает описание большинства наиболее применяемых гидрогелей, их материалов и подходов, показывающих возможность их использования в конструировании тканей для клинического применения. Будут представлены примеры in vitro и in vivo исследований, обсуждены достоинства и недостатки каждого материала. Полное подробное описание всех используемых в настоящее время гидрогелей лежит за рамками данной главы.

Ферментное расщепление тромбином растворимого фибриногена, белка плазмы крови, приводит к самопроизвольной полимеризации в физиологических условиях (Frenkel and Di Cesare, 2004). В результате образуется мягкий гель, способный обеспечивать рост и функционирование хондроцитов. Xu et al. (2005) описал образование гибкого ухообразного конструкта, полученного из хондроцитов сустава свиньи, инкапсулированных в конструкт из фибрина, который был затем покрыт с двух сторон слоями иофилизованной надхрящницы. Данный конструкт был имплантирован в голую мышь, подвергался сильным механическим нагрузкам после 6 недель (находясь еще имплантированным). После 12 недель имплантант извлекли и изучили с помощью гистологического анализа. Контрольные конструкты были сформированы без надхрящницы. Экспериментальные и контрольные образцы были одинаковы по размерам, гистологическому строению, с хорошо сформированной хрящевой тканью. Экспериментальные конструкты были значительно более гибкими, чем контрольные, и гораздо более приближены по свойствам к природному ушному хрящу. Однако было отмечено, что гидрогели на базе фибрина показывали несообразный рост хряща в иммунодефицитных организмах.

В независимом эксперименте Westreich et al (2004) показал стойкую успешную аутотрансплантацию кроличьих суставных хондроцитов, инкапсулированных в Tisseel, коммерчески производимый препарат человеческого фибрина. Конструкты содержали или не содержали IGF-1, а также основной фактор роста фибробластов. Конструкты были подкожно имплантированы, затем по истечении 3х месяцев извлечены и изучены на предмет выживаемости хондроцитов, продукции матрикса, некроза, воспаления и ангиогенеза. Известно, что 85% конструктов, приготовленных без фактора роста, образовывали хрящеподобную ткань, по сравнению только с 28% в случае с добавлением фактора роста. Этот эксперимент показал, что хрящ может быть сформирован с довольно большим успехом при применении фибриновых подложек. Преимущество фибрина заключается в том, что он является коммерчески производимым веществом, используемым уже во многих клиниках. Однако при первом образовании он не является механически сильным, что нежелательно для применения при тяжелых нагрузках.

Хитозан является полисахаридом, полученным из хитина (компонента экзоскелета членистоногих), который был частично или полностью деацетилирован (Chenite et al., 2000). Это катионный полимер, составленный из линейных цепей Р-связанных остатков d-глюкозамина. Алкалинизация водных растворов хитозана при рН больше 6.2 приводит к преципитации гидрогелей в результате воздействия ионных сил (Hoemann et al, 2005). Chenite et al. (2000) описал смешение хитозана с глицерин фосфатом для синтеза гидрогеля, жидкого при комнатной температуре и физиологичных значениях рН, но образующего гель при температурах тела. Хондроциты, смешенные с термогелеобразующим хитозаном, были культивированы in vitro или имплантированы подкожно в мышь. Подкожные имплантанты были выделены через 4 недели и изучены с помощью гистологического анализа на образование матрикса (окраска по Von Kossa) и окрашены толуидиновым синим. In vitro конструкты были анализированы на выживаемость хондроцитов и их фенотип, а также была изучена продукция матрикса. Hoemann et al (2005) использовал термогелеобразование гидрогелей из хитозана для инкапсуляции хондроцитов для культуры in vitro, а также для имплантации в поврежденный суставной хрящ кролика. Конструкты были изучены после 1 месяца пребывания в организме в условиях полной функциональной нагрузки, хотя временной период не влиял на образование хряща.

Хитозан представляет собой многообещающий субстрат для конструирования хрящевой ткани. Его химический состав напрямую влияет на его свойства in vivo. При повышении уровня деацитилирования хитозана, время его пребывания in vivo повышается, а воспалительная реакция снижается (Chenite, 2000). Хитозан как поликатионная молекула в норме связывается с биологическими тканями, обычно имеющими на поверхности негативный заряд. Это может объяснить его способность удерживаться в области повреждения сустава кролика, несмотря на свободное сочленение сустава (Hoemann et al., 2005) и на изначальное отсутствие у хитозана механической прочности. В добавок ко всему, приготовление хитозана не связано с потенциально токсичными связывающими агентами или органическими растворителями, тем самым сводя к минимуму токсичность для инкапсулированных клеток или организма-реципиента (Chenite et al., 2000).

Альгинаты представляют собой полисахариды из морских водорослей, состоящие из семейства линейных сополимеров маннуронат-гулуроната, отличающихся их последовательностью и специфическим составом (Rowley et al., 1999). Добавление бивалентных катионов, таких как кальций, приводит к полимеризации альгинатов и формированию нерастворимого гидрогеля. Полимеризация альгинатов регулируется ионными силами и полностью обратима хелатированием бивалентных катионов, используемых для полимеризации (Paige et al., 1996). Гидрогели из альгинатов использовались для инкапсуляции хондроцитов и для доставки факторов роста (Suzuki et al., 2000).

Хорошо изучена поддержка роста и секреции матрикса хондроцитов во время культивирования в объемных средах из альгината (Paige et al., 1996; Rowley et al., 1999; Kamil et al., 2004; Chia et al., 2005). Chia et al. (2005) культивировал хондроциты носовой перегородки человека в альгинатах и сравнивал их с контрольной монослойной культурой. Изучались пролиферация, синтез коллагена и синтез GAG. Хондроциты, культивируемые в альгинатах, пролиферировали меньше, чем те, которые росли в монослое, однако секретировали больше GAG и коллагена II типа. Для сравнения, хондроциты из монослойной культуры показывали гораздо более высокий уровень синтеза коллагена I и минимальную секрецию GAG.

Гидрогели из альгинатов используются для конструирования тканей хряща, так как они нетоксичны, их легко получать, и они имеют минимальный воспалительный ответ (Kamil et al., 2004). Механическая прочность большинства гидрогелей достаточна для нетяжелых нагрузок, или для имплантации после in vitro или in vivo культур на несколько недель, но их первоначальная хрупкость является проблемой для условий с сильными воздействиями, такими как переноска грузов. Одним из интересных применений альгинатов стало стимулирование фенотипа хондроцитов и повышение функционирования в культуре in vitro. После культивирования гидрогель растворяют хелатирующими агентами, и выделенные хондроциты пригодны для повторного использования, т.е. для аутологической трансплантации хондроцитов (Diduch et al., 2000; Homicz et al., 2003). Другие ученые изучали влияние изменения альгинатов для более четкого контроля за механическими свойствами и скоростью распада. В этом подходе применялось изменение молекулярного веса составляющих гель полимерных цепей, а также функционирование остатков вдоль полисахаридной цепи в определенном порядке для создания ковалентных поперечных сшивок с более предсказуемыми механическими и деградирующими характеристиками (Kong et al., 2004; Lee et al., 2001,2004b; Boontheekul et al., 2005).

Homicz et al (2003) изучал дедифференцировку хондроцитов носовой перегородки носа человека в трех различных системах: альгинатной, волокнах PGA и плотном монослое. Хондроциты перед переносом в эти системы претерпевали выделение в монослой, после чего долго имели фибробластоподобную структуру. Морфологический анализ, оценка пролиферации и синтеза GAG. Хондроциты восстанавливали их природную морфологию в альгинатных культурах и продуцировали большое количество GAG, хотя их пролиферация была значительно снижена по сравнению с пролиферацией в плотном монослое. Напротив, хондроциты пролиферирировали в плотном монослое, однако общее количество GAG и GAG на клетку было существенно ниже, чем у клеток, растущих в альгинате.

Гиалурон, гиалуроновая кислота (ГК) – полисахарид, найденный во внеклеточном матриксе хряща и синовиальной жидкости. Инъекции гиалурона уже использовались для лечения симптомов остеоартрита, и гиалурон показал стимулирующий эффект на секрецию матрикса хондроцитами (Akmal et al., 2005). Ниалографт С, коммерчески доступный трансплантат, состоящий из автологических хондроцитов, высееваемых на предварительно подготовленную подложку из ГК, используется в клинике в Европе с 1999 для лечения полнослойных остеохондрозных повреждений (Marcacci et al, 2005). Nettles et al (2004) недавно описали синтез метакрилат-измененного гиалурона, который при смешении с фотоинициатором способен к фото-сшиванию in situ и образованию стабильного гидрогеля. Этот гидрогель похож на остальные по механическим характеристикам и поддерживает рост хондроцитов и секрецию матрикса in vitro. Также было отмечено, что применение фото-сшивающегося гиалурана при остеохондрозных повреждениях сустава колена кролика, без клеток или факторов роста, приводило к инфильтрации окружающих клеток в гидрогель и образованию ткани за 2 недели. Это новообразование хряща было хорошо интегрировано в окружающую ткань, но на самом деле являлось волокнистой хрящевой тканью. Свойства гиалуроновых гидрогелей могут быть легко изменены путем изменения количества гиалурона, уровня его модификаций (метакрилирования), количества сшивок, химической структурой модифицирующих веществ (Nettles et al, 2004), а также добавлением специфического компонента, такого как RGD-содержащего белка клеточной адгезии и ростовых факторов (Hsu et al, 2004). В дальнейших исследованиях необходимо определить пригодность гиалуроновых гидрогелей для решения различных клинических задач.

PEO является синтетическим полимером, используемым в конструировании ткани хряща. Форма РЕО с низким молекулярным весом известна как PEG. Она может быть преобразована в фото-сшиваемый полимер, в ответ на свет образующий твердый гидрогель. Этот фотополимер может быть использован для инкапсуляции хондроцитов и ростовых факторов для применения в конструировании тканей (Elisseeff et aL, 1999a, 1999b). Вокруг фотополимеризующихся полимеров всегда существует постоянный интерес, так как они требуют минимальных инвазивных воздействий и позволяют контролировать конструируемые ткани изначально (Elisseeff et aL, 1999a, 1999b).

Было отмечено, что изменение плотности сшивок в полимеризованном гидрогеле сильно влияет на пролиферацию хондроцитов и синтез матрикса. Bryant et aL (2004) инкапсулировал хондроциты в гидрогели из PEG с двумя различными плотностями сшивок (10% и 20%) полиэтиленгликоль диметилакрилата (PEGDM), при свободном набухании и динамической загрузке. Полученные данные о пролиферации клеток и синтезе GAG показали, что более высокая плотность сшивок была связана с низкой пролиферацией и низким уровнем синтеза GAG. К тому же, динамическая загрузка (0-15% компрессии при 1Гц) привела к значительному снижению пролиферации по сравнению с контролем, и значительно меньшим синтезом GAG в 20% PEGDM гидрогеле.

Изменения в скорости деградации гидрогеля также имеют значительное влияние на структуру конструируемой ткани. Bryant et al (2003) создал гидрогель, состоящий из сополимера разлагающегося PLA-6-PEG-6-PLA и неразлагающегося PEGDM. Изменение соотношения деградируемых и недеградируемых компонентов позволило создать гидрогели с рядом параметров деградации. Было замечено, что содержание тотальной ДНК после культивирования в гидрогелях с 75-85% содержанием деградируемых сополимеров in vitro в течение 6 недель практически в 2 раза превышало аналогичное значение при культивировании в гидрогелях с 50% содержанием деградируемых полимеров. Кроме того, общее содержание коллагена в 85% гидрогеле значительно превышало его количество в 50% геле. Интересно, что деградация гидрогелей имела значительное влияние на распределение секретируемых компонентов матрикса. Гели с большим содержанием деградируемых сшивок показывали распределение коллагена II по всему гелю, а в 50% гелях коллаген II типа располагался в околоклеточном пространстве.

Наша группа и другие ученые изучали строение костно-хрящевых конструируемых тканей с помощью двухслойных имплантантов с последующей фотополимеризацией (Alhadlaq и Mao, 2003, 2005). Улучшение этой техники включает в себя объемную фотолитографию. В основе этого метода, описанного Liu и Bhatia (2002), лежит использованной специальной отпечатанной маски для избирательной фотополимеризации раствора PEGDА, содержащего флуоресцентно-меченные клетки внутри специально сконструированных камер. Использование нескольких масок в последовательности позволило получить комплекс с высоким разрешением и пространственно организованной структурой, содержащей отдельные клеточные популяции. Таким образом, использование фото-сшивающихся полимеров имеет большой потенциал для конструирования сложных комплексных систем, которые могут быть очень сходными с природными тканями.

Поливинилалкоголь (PVA) синтезируется из поливинилацетата путем гидролиза, алколиза и аминолиза (Lee and Mooney, 2001). Он формирует гидрогели, образуя ковалентные поперечные сшивки в присутствии глутарового альдегида в кислой среде (Nuttelman et al., 2001). Однажды полимеризовавшись, он существенно не распадается in vivo, хотя фотополимеризующиеся деградируемые гидрогели на основе PVA были описаны (Nuttelman et al., 2002). Первым достоинством PVA является формирование им прочной, эластичной и гибкой структуры гидрогеля, имеющей много функциональных сайтов для связывания белков, факторов роста и адгезионных молекул. Например, Nuttelman et al. (2001) синтезировал гидрогель на основе PVA, ковалентно связанного с фибронектином. На этой подложке он изучал прикрепление фибробластов и пролиферацию. Прикрепление фибробластов значительно возрастало на модифицированном PVA-гидрогеле, по сравнению с немодифицированным PVA, а пролиферация превышала уровни пролиферации в клетках, выращиваемых на полистерине. Тем не менее, полимеризация PVA требует реагентов и условий, которые не подходят для in situ операций.

Новый класс синтетических пептидов спонтанно собирается и формирует гидрогели, основанные на изменениях рН и/или ионной силы. Эти пептиды характеризуются самокомплементарной структурой обычно различающихся блоков положительно и отрицательно заряженных остатков, разделенных гидрофобными остатками (Holmes, 2002). Эти пептиды самособираются при определенных условиях рН и ионной силы и формируют P-sheet структуры, которые затем соединяются и формируют гидрогель из переплетающихся нанофибрилл (Kisiday et al, 2002). Уникальная структура этих гидрогелей заключается в их фибриллярной микроструктуре, которая приблизительно в три раза меньше, чем структура полимерных гидрогелей (Holmes, 2002). Kisiday et al. (2002) инкапсулировал хондроциты в пептидный гидрогель для объемного культивирования in vitro. Большинство хондроцитов имело фенотип и уровень секреции как и в других гидрогелях, но пролиферация культивируемых хондроцитов в пептидных гидрогелях была значительно выше, чем в агарозных (Kisiday et al., 2002, 2004). Пептидные гидрогели предлагают почти бесконечное количество вариантов потенциального строения гидрогелей, благодаря возможности изменять последовательность и сочетание различных составных пептидов. К тому же, функциональные домены, такие как RGD мотив клеточной адгезии, могут быть легко включены в состав пептида (Holmes, 2002).